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AxyPrep無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量試劑盒

本試劑盒采用 SDS 堿裂解法，結(jié)合 DNA 制備膜選擇性吸附 DNA。同時(shí)采用特殊溶液（Buffer ETR 和 Buffer PF）有效去除內(nèi)毒素，可從 80-200 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取出多至 500 礸 高純度質(zhì)粒 DNA，其內(nèi)毒素水平控制在 0.1 EU/礸 以下。

一、 試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性

RNase A：50 mg/ml，室溫可貯存 6 個(gè)月，長(zhǎng)期貯存于-20℃。

Buffer S1：細(xì)菌懸浮液。加入 RNase A 后，混合均勻，4℃貯存。

Buffer S2：細(xì)菌裂解液（含 SDS/NaOH），室溫密閉貯存。

Buffer S3K：中和液，室溫密閉貯存。

Buffer B：DNA 結(jié)合溶液，室溫密閉貯存。

Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。

Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇（可用無(wú)水乙醇或 95%乙醇）。混合均勻，室溫密閉貯存。

ET-free water (70% Ethanol)：使用前，按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇（可用無(wú)水乙醇或 95%乙醇）?；旌暇鶆?，室溫密閉貯存。

Eluent A：洗脫液。室溫密閉貯存。

Buffer ETR：內(nèi)毒素去除液。室溫密閉貯存。

Buffer PF：分相緩沖液。室溫密閉貯存。

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二、 注意事項(xiàng)

• 細(xì)菌過(guò)量將影響細(xì)菌裂解、質(zhì)粒 DNA 的釋放，導(dǎo)致內(nèi)毒素含量過(guò)高。

• 步驟 3 和步驟 4 的操作必須溫和。劇烈搖晃將導(dǎo)致基因組 DNA 的污染。但混合必須充分，否則影響得率。

• 在加入 Buffer S3K 時(shí)，蛋白質(zhì)和基因組 DNA 形成粘稠的白色絮狀沉淀，必須充分混合均勻，使凝集塊中間也得到充分中和凝結(jié)。

• Buffer S2、Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer W1 含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和防護(hù)眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣物，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢(xún)。

三、 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

• 次使用前，RNase A 全部加入 Buffer S1 中，4℃貯存。

• 次使用前，Buffer W2 concentrate 中加入體積的無(wú)水乙醇。

• 次使用前，ET-free water (70% Ethanol)中加入體積的無(wú)水乙醇。使用前置于-20℃預(yù)冷。

• 使用前，檢查 Buffer S2 是否出現(xiàn)沉淀，如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)于 37℃溫浴加熱溶解并冷卻至室溫后使用。

• Eluent A 在 65℃預(yù)熱后使用，有利于提高質(zhì)粒得率。

• Buffer S3K、Buffer B 和 Buffer ETR 使用前置于 4℃預(yù)冷。

• 準(zhǔn)備無(wú)核酸和核酸酶污染的 Tip 頭、50ml 離心管。

• 水平離心機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)到 4,000×g）及冷凍離心機(jī)（轉(zhuǎn)速可達(dá)到 8,000×g）

• 準(zhǔn)備 56℃水浴。

四、 操作步驟

取 80-200 ml 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液（若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少），3,000 ×g 離心 8 min，棄上清。將離心管倒置于紙巾上 1 min，除盡上清。

• 一般過(guò)夜培養(yǎng)的菌液 OD600 在 2.0-4.0 之間。若菌液 OD600 >4，菌量需減少。

加 10 ml Buffer S1，懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。

確認(rèn) Buffer S1 中已加入 RNase A。

加 10 ml Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過(guò) 5 min。

• Buffer S2 使用后立即蓋緊瓶蓋，以免空氣中的 CO2 中和 Buffer S2 中的 NaOH，降低溶菌效率。

避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組 DNA 污染。

此步驟不宜超過(guò) 5 min。

• 加 10 ml 4℃預(yù)冷的 Buffer S3K，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合，直至溶液顏色均一并形成緊實(shí)的凝集塊，室溫放置 5 min。
  • 加入 Buffer S3K 后應(yīng)立即混合，以避免形成局部的凝結(jié)塊。

• 避免劇烈搖晃，否則將導(dǎo)致基因組 DNA 污染。

5.加 10 ml 4℃預(yù)冷的 Buffer B，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合 10 次，8,000×g 離心（4℃）10 min。

步驟 6-9 可以選擇離心法或負(fù)壓法。

• 離心法：

6A. 先將大量制備管放入 50 ml 離心管中。吸取步驟 5 中的混合液，轉(zhuǎn)移到大量濾器（Maxiprep syringe filter）中。

7A. 插入推桿，垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中，≥6,000×g 離心 5 min。

 8A. 棄濾液，加 12 ml Buffer W1 至制備管中，≥6,000×g 離心 5 min。

9A. 棄濾液，加 14 ml Buffer W2 至制備管中，≥6,000×g 離心 5 min。

• 確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。

• 負(fù)壓法：

6B. 正確連接負(fù)壓裝置，將大量制備管插到負(fù)壓裝置的插口上。

7B. 吸取步驟 5 中的上清液，轉(zhuǎn)移到大量濾器中，插入推桿，垂直向下緩慢將濾液推注至大量制備管中，開(kāi)啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-25 ~ -30 英寸汞柱，緩慢吸走管中溶液。

8B. 保持負(fù)壓，加 12 ml Buffer W1，吸盡管中溶液。

9B. 保持負(fù)壓，加 14 ml Buffer W2，吸盡管中溶液。

確認(rèn)在 Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。

再在大量制備管中加 4 ml Buffer W2，≥6,000×g 離心 5 min。

將制備管置于另一潔凈 50 ml 離心管中，在制備管膜中央加 2 ml Eluent A，室溫靜置 5 min，≥6,000×g 離心 5 min 收集質(zhì)粒 DNA。

將 Eluent A 加熱至 65℃將提高洗脫效率。

棄制備管。在濾液中加入 4 ml 預(yù)冷的 Buffer ETR，混合均勻。

如果 Buffer ETR 渾濁，于冰上靜置，直至溶液變得清亮；如果分層，則混合均勻。

加入 1 ml Buffer PF，混合均勻。

*溶液可能會(huì)出現(xiàn)微弱的渾濁現(xiàn)象，此為正?，F(xiàn)象。

置于 56°C 孵育 8 min。室溫 4,000×g 離心 5 min。

孵育后溶液將出現(xiàn)大量乳白色沉淀，否則延長(zhǎng)孵育時(shí)間。

孵育后溶液有可能出現(xiàn)分層現(xiàn)象，此為正?，F(xiàn)象。

此步驟的離心必須使用吊籃式（swing-out rotor）離心機(jī)或其他水平離心機(jī)

取無(wú)色上相至 50 ml 離心管中，加入 0.8 倍體積異丙醇（如：取得 6 ml 無(wú)色上相，則加入 4.8 ml 異丙醇），混合均勻。室溫靜置 10 min。8,000×g 離心 10 min。盡可能棄盡上清。加入 2 ml 預(yù)冷的 ET-free water（70% Ethanol），洗滌沉淀，8,000×g 離心 5 min。

ET-free water（70% Ethanol）使用前確定已加入體積的無(wú)水乙醇。

盡可能棄盡上清。在超凈臺(tái)中干燥 10-15 min。

管壁上殘留液體可短暫離心后吸棄。

加入 500 祃 Eluent A 或無(wú)內(nèi)毒素水溶解質(zhì)粒 DNA。

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